sábado, 26 de septiembre de 2009

Tinción GRAM

Práctica de laboratorio.
COLORACION DE GRAM Y ZN MECANISMO DE COLORACIÓN Y DIFERENCIACIÓN

La coloración de Gram fue descubierta hace algo mas de 100 años por Hans Chistian Gram, se usa principalmente para el examen microscópico directo de muestras y de subcultivos.
El cristal violeta (violeta de genciana) sirve como colorante primario, y se une a la pared celular bacteriana luego de un tratamiento con una solución débil de yodo que sirve como mordiente para la unión del colorante.
Algunas especies de bacterias, debido a la naturaleza química de sus paredes celulares, tiene la capacidad de retener el cristal violeta incluso después de un tratamiento con un decolorante orgánico, como por ejemplo una mezcla en partes iguales de alcohol etílico al 95% y acetona.
Las bacterias que retienen el colorante se ven negroazuladas cuando se observan al microscopio, y se denominan entonces grampositivas.
Algunas bacterias pierden la coloración primaria con cristal violeta cuando son tratadas con el colorante, presumiblemente debido al alto contenido de lípidos de su pared celular.
Estas bacterias decoloradas toman el colorante de contraste, la safranina, y se ven rojas cuando se observan al microscopio, denominándose gramnegativas.
La visualización de ciertos bacilos gramnegativos delicados puede ser mejorada adicionando carbolfucsina a la sapronina del colorante de contraste.
INTERPRETACIÓN Las aplicaciones mas comunes de la coloración de Gram han sido reseñadas por Friedly:
  • La presencia de cocos grampositivos agrupados sugiere estafilococos;
  • En cadenas sugiere estreptococos.
  • Los diplococos grampositivos en forma de lanceta, particularmente cuando se observan extendidos realizados a partir de muestras de esputo, son característicos de Streptococcus pneumoniae.
  • Los diplocococs gramnegativos con forma de riñón son característicos de especies de Neiseria. Los grampositivos grandes sugieren especies de Bacillus o Clostrudium.
  • Los bacilos grampositivos pequeños sugieren especies de Listeria o de una de las corineiformes (difteroides) si se observan disposiciones en forma de letras chinas.
  • Los bastones gramnegativos curvos en muestras de materia fecal sugieren las presencia de especies de Vibrio o, si también se ven formas de tirabuzón, de Campylobacter.
  • Los bacilos gramnegtivos son las bacterias mas comúnmente halladas en los laboratorios clínicos, e incluyen a Enterobacteriaceae, bacilos no fermentadores, especies de Haemophilus y diversas especies delicadas.

DIFERENCIAS ENTRE BACTERIAS GRAMPOSITIVAS Y GRAMNEGATIVAS

  • La diferencia principal entre estos dos grupos consiste en que la pared celular de las bacterias grampositivas está constituida por 50 a 90% de mucopéptidos, mientras que la fracción de éstos en las bacterias gramnegativas es de solo 5 a 10%; estas últimas tienen una gruesa capa externa formada por un complejo de fosfolípidos, polisacáridos y proteínas. En la pared de las bacterias grampositivas, pero no en las gramnegativas, se presentan polímeros de glicerol-fosfato o de ribitol-fosfato, los cuales se conocen como ácidos teicoicos.
  • OTRAS OBSERVACIONES La coloración de Gram también puede ser utilizada para identificar formas no bacterianas, como las tricomonas, larvas estrongiloides, los quistes de Pneumocystis carinii y los trofozoitos de Toxoplasma gondii, si bien no es tan sensitiva como otras tinciones específicas utilizadas para la visualización de estos parásitos. Estas aplicaciones variadas demuestran la versatilidad de la coloración de Gram .

MATERIAL BIOLOGICO

  • Muestra biológica

EQUIPO: Mechero, Microscopio óptico, Platina caliente, Portaobjetos, Guantes, Cubrebocas, Hisopos, Frascos goteros.

SUSTANCIAS: Colorante cristal violeta, Colorante de safranina, Aceite de inmersión, Lugol, Alcohol etílico absoluto, Colorante carbolfucsina, Colorante azul de metileno, Solución de alcohol-acetona, Solución de alcohol ácido.

TÉCNICA:

  1. Hacer un extendido delgado del material para estudio, y permitir que se seque al aire.
  2. Fijar el material al portaobjetos, pasándolo tres o cuatro veces a través de la llama de un mechero de bunsen, de modo que el material no se lave durante el procedimiento de tinción. Se recomienda el uso de alcohol para fijar el material a ser teñido con Gram (cubrir el extendido con metanol o etanol por unos pocos minutos).
  3. Colocar el extendido en una bandeja para teñido, y cubrir la superficie con una solución de cristal-violeta.
  4. Después de un minuto (con algunas soluciones puede emplearse menos tiempo) de exposición al colorante de cristal violeta, lavar minuciosamente con agua destilada o buffer.
  5. Cubrir el extendido con la solución de yodo para Gram durante 1 minuto. Lavar nuevamente con agua.
  6. Sostener el extendido entre el pulgar y el índice, y cubrir la superficie con unas pocas gotas del decolorante alcohol-acetona, hasta que no se arrastre mas violeta. Esto lleva usualmente 10 segundos o menos.
  7. Lavar con agua corriente y volver a ubicar el extendido sobre la bandeja de tinción. Colocar sobre la superficie safranina de contraste durante un minuto. Lavar con agua corriente.
  8. Ubicar el extendido en posición vertical en una bandeja de tinción, permitiendo que se escurra el exceso de agua y el extendido se seque.
  9. Examinar el extendido bajo un objetivo de inmersión x 100(aceite).

Las bacterias grampositivas se tiñen de azul obscuro; las gramnegativas aparecen rosa pálidas. COLORACIÓN ALCOHOL-ACIDO-RESITENTES Las micobacterias están cubiertas por un material grueso, ceroso, que resiste la tinción; no obstante, un vez que se tiñen las paredes celulares bacterianas resisten la decoloración por solventes orgánicos fuertes, como el alcohol ácido, debido a que la carbulfucsina se une al ácido micólico de la pared celular micobacteriana. Consecuentemente, dichas bacterias son conocidas como resistentes al ácido, un fenómeno descubierto en 1881 por Ziehl y Neelsen. Se requiere un tratamiento especial para que el colorante primario, la carbolfusina, penetre en el material ceroso de los bacilos resistentes al ácido. En la técnica convencional de Ziehl-Neelsen se utiliza calor. Una vez que la carbolfucsina se deposita en al superficie del extendido a teñir, se pasa por debajo del portaobjetos, hacia atrás y hacia delante, la flama de un mechero de bunsen. El calentamiento del extendido prosigue hasta el desprendimiento de vapores, y se detiene poco antes de la ebullición. La modificación de Kinyoun a la técnica de alcohol-ácido se denomina “método frío” porque utiliza un detergente tensoactivo como el tergitol, en lugar de tratamiento con calor. Con cualquiere de estas tinciones, los bacilos resitentes al ácido se ven rojos contra un fondo verde o azul, lo que depende del colorante de contraste. Si bien este método es satisfactorio para la mayoría de las micobacterias, algunas cepas de bacterias alcohol-acido débiles de espcies de crecimiento rápido (complejo Mycobacterium fortuitum/chelonae) se tiñen mejor con el método de Ziehl-Neelsen.

REPORTE DE LA PRÁCTICA.

Tipo de muestra:_______________________________________

Característica de la muestra:_______________________________

  1. DESCRIBA LAS OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS DEL FROTIS TEÑIDO CON GRAM.
  2. DIBUJE LAS OBSERVACIONES REALIZADAS, ESPECIFICANDO LOS ELEMENTOS MICROSCOPICOS IDENTIFICADOS (CÉLULA, MICROORGANISMO, ETC.) OBSERVACIÓN: DEBE GUARDAR LA PROPORCION EN TAMAÑO.
  3. Anexe sus laminillas teñidas
  4. Escriba tres diferencias estructurales entre bacterias grampositivas y gramnegativas
  5. DESCRIBA LAS OBSERVACIONES MICROSCÓPICAS DEL FROTIS TEÑIDO CON ZIEHL NEELSEN
  6. DIBUJE LAS OBSERVACIONES REALIZADAS, ESPECIFICANDO LOS ELEMENTOS MICROSCOPICOS IDENTIFICADOS (CÉLULAS, MICROORGANISMOS, ETC.) OBSERVACIÓN: DEBE GUARDAR LA PROPORCION EN TAMAÑO.
  7. Anexe sus laminillas teñidas

SUERTE!!

Tarea, Septiembre 2009

HOLA ALUMNOS LAS ACTIVIDADES A REALIZAR SON LAS SIGUIENTES. Como primer unidad del modulo, tenemos los microorganismos y sus morfologías, de tal manera que la actividad a realizar es un mapa conceptual que tiene que ver con éstos contenidos. Ustedes podrán encontrar la lectura en la siguiente dirección:

http://www.monografias.com/trabajos15/microbiologia/microbiologia.shtml y en esta otra. http://recursos.cnice.mec.es/biologia/principal.php?op=ud7&id=50

Buen día. bye

Curso de microbiología. Agosto 2009- Enero 2010

Hola, buenos días estimados alumnos que hoy ingresan una nueva etapa de su vida en nuestro CBTis 19 de la Ciudad de Colima.

Mi nombre es Janet Pineda Rincón, seré su maestra de la asignatura "Identificación de
microorganismos mediante análisis microbiológicos" a lo largo del semestre.

Este será nuestro espacio para comunicarnos, donde les indicare las actividades a realizar, dichas actividades serán por semana, intentaremos trabajar un curso a distancia parcial, ya que será necesario vernos como lo marca nuestro horario de clase, pero variaremos la finalidad, e decir en éste espacio ustedes verán reflejadas las actividades que tendrán que realizar en clase, con sus compañeros y además tndrán un espacio disponible para que depositen sus conclusiones o demás actividades que sean solicitadas.

Bueno, iniciamos esta nueva aventura por el ciber espacio.

Buena suerte y sean todos ustedes bienvenidos.mis datos para que puedan comunicarse de manera personal son: correos: janetpineda19@gmail.com tel cel (312)1257460